Результаты исследования Центром коллективного пользования научным оборудованием «Арктика» экстракта фукуса на содержание аминокислот и витаминов

Заказчик: ООО «Архангельский водорослевый комбинат» Наименование объекта исследования:

Дата поступления: 26.03.2020

Дата оформления протокола: 06.04.2020

Техническое задание:

1. Определение содержания аминокислот (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистин, глицин, гистидин, глутаминовая кислота, пролин, таурин, тирозин, серин);
   
2. Определение содержания водорастворимых витаминов В1,В2,ВЗ,В6,В7,В12,С.

Результаты измерения:

Количественное определение аминокислотного состава пробы 206-L проводили методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией с нингидрином.

Анализ выполнялся с использованием аминокислотного анализатора Biochrom 30+ (Biochrom, Великобритания). Разделение проводили на хроматографической колонке Sodium High Performance Protein Hydrolysate Column (Biochrom, Великобритания), 4.6х150 мм. В качестве подвижной фазы использовались натриевые буферные растворы:

Элюирование аналитов проводили по следующей программе переключения буферных растворов:

В качестве дериватизирующего агента выступал раствор нингидрина (Sevko&Co, Россия), скорость подачи - 20 мл/ч. Температура реакционной ячейки 135 °С. Объем вводимой пробы - 20 мкл. Детектирование проводили спектрофотометрически на длинах волн 440 и 570 нм.

Калибровку системы осуществляли с использованием стандартного раствора аминокислот (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией каждой аминокислоты 2,5 мкМоль/мл, разбавленного в 10 раз загрузочным буферным раствором с pH 2,20 (Biochrom, Великобритания).

Пробоподготовка. 1 мл экстракта водорослей (образец 206-L) разбавляли в 10 раз натрий-цитратным загрузочным буфером с pH 2,20, центрифугировали в течение 5 минут при 14 000 об/мин, фугат отфильтровывали с помощью нейлонового мембранного фильтра (размер пор 0,22 мкм) и вводили в хроматографическую систему.

Результаты определения содержания аминокислот в образце 206-L:

Примечание:
*- не обнаружено
** - таурин не определялся ввиду отсутствия стандартного образца для калибровки системы.

Количественное определение витаминов.

Пробоподготовка: жидкие пробы (1 мл) фильтровали через мембранный нейлоновый фильтр (0,2мкм) и вводили в систему ВЭЖХ-МС/МС.

Пастообразные/твердые образцы подвергали экстракции согласно [1]:

Взвешивали 0,1 г образца в виале на 15 мл, добавляли 4,6 мл воды и 0,4 мл NaOH 2 М и энергично встряхивали суспензию, затем 5 мл фосфатного буфера 1 М (дигидрофосфат моногидрат). Обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин в ультразвуковой ванне Elmasonic S15H (Elma, Германия). Экстракт фильтровали через мембранный нейлоновый фильтр (0,2мкм) и вводили в систему ВЭЖХ-МС/МС.

Так как экстракт водорослей оказался сложной матрицей, решили отказаться от использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием. Определение водорастворимых витаминов проводили методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (МС/МС).

Использовали систему ВЭЖХ-МС/МС, состоящая из тандемного массспектрометра с тройным квадруполем LCMS-8040, оснащенного источником ИЭР, а также жидкостного хроматографа LC-30 «Nexera» (Shimadzu, Япония), включающего два насоса LC-30AD с формированием градиента на стороне высокого давления, пятиканальный дегазатор DGU-A5, автосамплер LC-30AC, термостат колонок СТО-З0А. Управление системой ВЭЖХ-МС/МС, сбор и обработка данных осуществлялись с помощью программного пакета LabSolutions 5.65 (Shimadzu, Япония).

Разделение проводили на неподвижной фазе Zorbax SB-Aq, 150х3,0 мм, размер частиц сорбента 3,5 мкм (Agilent, США), при 35°С и 0,6 мл/мин. В качестве элюента использовалась смесь 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (раствор А) с ацетонитрилом (раствор В). Градиентная программа: 0-5 мин 0% В, 15 мин: 30% В.

Результаты определения:

Примечание:
ПО – предел обнаружения 0,01 мг/л