Snow Sea
Архангельский завод морских водорослей
163000
Россия
Северо-Западный регион
Архангельск
Архангельск, Ленинградский пр., 328
+7(911)566–55–89
+7(911)566–55–89
export@snowsea.ru
Snow Sea

Snow Sea

Snow Sea

Архангельский завод морских водорослей

Snow Sea
2901138167
Нам 102 года

Организация

С(А)ФУ Центр коллективного пользования научным оборудованием «Арктика, 2020 г.

Результаты исследования Центром коллективного пользования научным оборудованием «Арктика» экстракта фукуса на содержание аминокислот и витаминов

Заказчик: ООО «Архангельский водорослевый комбинат» Наименование объекта исследования:

Шифр проб Обозначение проб заказчиком
206-L
Экстракт фукуса
 

Дата поступления: 26.03.2020

Дата оформления протокола: 06.04.2020

Техническое задание:

  1. Определение содержания аминокислот (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистин, глицин, гистидин, глутаминовая кислота, пролин, таурин, тирозин, серин);
  2. Определение содержания водорастворимых витаминов В1,В2,ВЗ,В6,В7,В12,С.

Результаты измерения:

Количественное определение аминокислотного состава пробы 206-L проводили методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией с нингидрином.

Анализ выполнялся с использованием аминокислотного анализатора Biochrom 30+ (Biochrom, Великобритания). Разделение проводили на хроматографической колонке Sodium High Performance Protein Hydrolysate Column (Biochrom, Великобритания), 4.6х150 мм. В качестве подвижной фазы использовались натриевые буферные растворы:

№ Буфера
Компонент
Концентрация, Моль
pH
1
Натрий-цитратный буфер (А)
0,20
2,80
2
Натрий-цитратный буфер (В)
0,30
3,00
5
Натрий-цитратный буфер
1,65
3,55
6
Раствор гидроксида натрия
0,30
-

Элюирование аналитов проводили по следующей программе переключения буферных растворов:

№ 
Время, мин
Температура, °С
Буфер
Скорость потока, мл/ч 
1
1,0
48
1
25,0
2
21,0
48
2
25,0
3
20,15
52
2
25,0
4
0,45
52
5
25,0
5
20,0
95
5
25,0
6
4,0
95
6
25,0
7
4,0
95
1
25,0
8
2,0
48
0
0,0
9 8,0
48
1
33,0
10 4,0
48
1
25,0

В качестве дериватизирующего агента выступал раствор нингидрина (Sevko&Co, Россия), скорость подачи - 20 мл/ч. Температура реакционной ячейки 135 °С. Объем вводимой пробы - 20 мкл. Детектирование проводили спектрофотометрически на длинах волн 440 и 570 нм.

Калибровку системы осуществляли с использованием стандартного раствора аминокислот (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией каждой аминокислоты 2,5 мкМоль/мл, разбавленного в 10 раз загрузочным буферным раствором с pH 2,20 (Biochrom, Великобритания).

Пробоподготовка. 1 мл экстракта водорослей (образец 206-L) разбавляли в 10 раз натрий-цитратным загрузочным буфером с pH 2,20, центрифугировали в течение 5 минут при 14 000 об/мин, фугат отфильтровывали с помощью нейлонового мембранного фильтра (размер пор 0,22 мкм) и вводили в хроматографическую систему.

Результаты определения содержания аминокислот в образце 206-L:

Компонент    Концентрация аминокислот в пробе, мг/л
Аспаргиновая кислота
63 ±5
Треонин
96 ±8
Серин
348 ±28
Глутаминовая кислота
247 ± 26
Пролин
135 ±11
Глицин
36 ±4
Аланин
1145 ±98
Цистеин
41 ±5
Валин
146 ± 12
Метионин
18 ± 2
Изолейцин
53 ±4
Лейцин
56 ±4
Тирозин
59 ±5
Фенилаланин
107 ±9
Гистидин
9,7 ± 0,9
Триптофан
-*
Лизин
11 ±1
Хлорид аммония
1280 ±125
Аргинин
127 ±11
Таурин
-**

Примечание:
*- не обнаружено
** - таурин не определялся ввиду отсутствия стандартного образца для калибровки системы.

Количественное определение витаминов.

Пробоподготовка: жидкие пробы (1 мл) фильтровали через мембранный нейлоновый фильтр (0,2мкм) и вводили в систему ВЭЖХ-МС/МС.

Пастообразные/твердые образцы подвергали экстракции согласно [1]:

Взвешивали 0,1 г образца в виале на 15 мл, добавляли 4,6 мл воды и 0,4 мл NaOH 2 М и энергично встряхивали суспензию, затем 5 мл фосфатного буфера 1 М (дигидрофосфат моногидрат). Обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин в ультразвуковой ванне Elmasonic S15H (Elma, Германия). Экстракт фильтровали через мембранный нейлоновый фильтр (0,2мкм) и вводили в систему ВЭЖХ-МС/МС.

Так как экстракт водорослей оказался сложной матрицей, решили отказаться от использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием. Определение водорастворимых витаминов проводили методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией (МС/МС).

Использовали систему ВЭЖХ-МС/МС, состоящая из тандемного массспектрометра с тройным квадруполем LCMS-8040, оснащенного источником ИЭР, а также жидкостного хроматографа LC-30 «Nexera» (Shimadzu, Япония), включающего два насоса LC-30AD с формированием градиента на стороне высокого давления, пятиканальный дегазатор DGU-A5, автосамплер LC-30AC, термостат колонок СТО-З0А. Управление системой ВЭЖХ-МС/МС, сбор и обработка данных осуществлялись с помощью программного пакета LabSolutions 5.65 (Shimadzu, Япония).

Разделение проводили на неподвижной фазе Zorbax SB-Aq, 150х3,0 мм, размер частиц сорбента 3,5 мкм (Agilent, США), при 35°С и 0,6 мл/мин. В качестве элюента использовалась смесь 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (раствор А) с ацетонитрилом (раствор В). Градиентная программа: 0-5 мин 0% В, 15 мин: 30% В.

Результаты определения:

Соединение 
Время, мин
Ионный переход, m/z
206-L, мг/л
В6 пиридоксамин
1,378
169,00>152,00
менее ПО
С аскорбиновая кислота
1,748
175,00>115,00
0,2
В1 тиамин
2,25
265,00>122,00
0,006
В6 пиридоксаль
2,346
168,00>150,00
0,023
В6 пиридоксин
2,743
170,00>134,00
0,152
ВЗ никотинамид
3,682
123,00>80,00
1,271
В7 биотин
12,467
245,00>227,00
0,003
В2 рибофлавин
12,558
377,00>243,00
1,777
В12 цианокобаламин
12,848
678,00>147,00
менее ПО

Примечание:
ПО – предел обнаружения 0,01 мг/л